علوم آزمایشگاهی
بهارشفایافتن مسرت پزشک ازدرمان شکربیمارازطراوت جسم درگرورسالت تشخیص توست...
 
 
شنبه 27 آذر 1389 :: نویسنده : امین شیرین نیا

ASO آنتی بادی علیه محصول خارج سلولی استوپتوکوک یا همولیزلیزینO است. 

روش: اجرای یک تست سریع آگلوتیناسیون لاتکس روی اسلاید بطور شایعی یک روزه مورد استفاده می باشد. روشهای قدیمی بر اساس رقیق نمودن داخل لوله همراه همولیز RBC بوده اند.واحد Todd بعنوان تصویری که نشان دهنده همولیز داخل لوله بود به کار می رفت . در حالی که واحد بین المللی (IU) با استفاده از لاتکس سریع که امروزه استفاده می گردد معادلی برای واحد Todd می باشد.

مقادیر نرمال : مقادیر طبیعی کمتر از 240-200 IU ( بر اساس نوع آزمایشگاه متفاوت است) می باشد که از روش لاتکس استفاده میشود. براساس روشهای گذشته شاخص طبیعی در بزرگسالان کمتر از 240 واحد Todd  و کمتر از 320 واحد Todd در کودکان بود.

موارد افزایش: با عفونت استوپتوکوکی پس از 5-4 هفته تیتر ASO به حداکثر خود می رسد( معمولا 3-2 هفته پس از شروع تب روماتیسمی حاد). در 90% بیماران با تب حاد روماتیسمی افزایش تیتر داریم در حالیکه پس از عفونت استروپتوکوک پوستی معمولا افزایش تیتر نداریم. ASO ممکن است در بیمارانی که هیپرگاماگلوبین دارند یا فعالیت ایمنولوژیک افزایش یافته است بصورت غیر اختصاصی بالا برود.

فاکتورهای مخدوش کننده: تیتر ASO با تغییر سن ، فصل و  جغرافیای منطقه متغیر می باشد . مقادیر بالاتر در کودکان و در کسانی که در جاهای شلوغ زندگی میکنند و در آب و هوای معتدل شایعتر است . آلودگی سرمی وواکنش متقاطع با سارکولم عضله ندرتا می تواند نتایج مثبت کاذبی را به همراه داشته باشد.

موارد کاربرد:ASO همراه با دیگر آنتی بادی های ضد استرپتوکوکی نظیر آنتی DNAseB و Anti-NAse ، آنتی استرپتوکیناز ، آنتی هیالورونیداز برای نشان دادن شواهد  عفونت استوپتوکوکی مفید می باشد.





نوع مطلب :
برچسب ها : ASO، استرپتولیزین،


شنبه 20 آذر 1389 :: نویسنده : امین شیرین نیا

السلام علیك یا ابا عبدالله الحسین





نوع مطلب :
برچسب ها :


جمعه 12 آذر 1389 :: نویسنده : امین شیرین نیا

PCR

اطلاعات اولیه

این روش فوق العاده ساده بوده و با استفاده از تغییرات حرارت می‌توان چندین فرآیند را به دنبال همدیگر انجام داد. با این تکنیک می‌توان به عنوان یک روش قدرتمند تشخیص بالینی (Diagnostic) برای وجود موتاسیون‌ها در ژنوم انسانی ، یا برای وارد کردن جهش‌های ویژه به داخل ژن همسانه شده ، استفاده کرد.

PCR بطور دستی و با قرار دادن پر زحمت و انتقال لوله‌های آزمایش بین حمام‌های آب دارای دمای لازم ، بوجود آمد. امروزه دستگاههایی بطور تجارتی تهیه می‌شوند که در آنها جایگاههای لوله‌ای با بلوک فلزی حرارت پذیر تعبیه شده است و قابل برنامه ریزی برای تغییر سریع بین دماهای لازم است. π چرخه PCR ، DNAی مورد نظر را 2π بار تکثیر می‌کند.

تاریخچه

در گذشته معمولا از روش های شیمیایی برای تولید قطعات نوکلئوتیدی استفاده می‌کردند، اما این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند از سال 1980 به بعد عمدتا از روش PCR در آزمایشگاههای زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود.

مراحل PCR

  • مرحله دناتوراسیون DNA: در مرحله اول برای مدت کوتاهی (30S) قطعات DNA را در درجه حرارت 94 درجه سانتیگراد حرارت می‌دهند تا دو زنجیره DNA از هم باز نشود.

  • مرحله پرایمر و مرحله اتصال دو قطعه نوکلئوتیدی: این قطعات معمولا از 25 - 18 باز آلی تشکیل می‌شوند و می‌توانند به قطعات مکمل خود که بر روی ژن مورد نظر قرار می‌گیرند، اتصال یابند. قطعه‌ای که در آن PCR به تعداد زیاد ساخته می‌شود. ما بین دو پرایمر ساخته می‌شود. مرحله اتصال پرایمرها کوتاه بوده و حدودا 30S در دمای 65 - 30 درجه سانتیگراد صورت می‌گیرد.

  • مرحله پلیمریزاسیون یا مرحله سنتز: در این مرحله با دخالت آنزیم DNA پلیمر از بر روی رشته DNA الگو. سنتز DNA با استفاده از نوکلئوتید تری فسفات‌هایی که در محلول وجود دارند، صورت می‌گیرد و برای سنتز DNA همیشه یک رشته DNA به صورت الگو و یک قطعه پلی نوکلئوتیدی به عنوان پرایمر مورد نیاز است.


ادامه PCR بعد از چرخه اول

بعد از این 3 مرحله ، چرخه اول تمام می‌شود، چرخه‌های بعدی تکرار چرخه اول است. بدین صورت به دنبال چرخه‌های متعدد PCR قطعه DNA مورد نظر بطور تصاعدی افزایش می‌یابد. یعنی از 20 چرخه ، ژن مورد نظر دارای بیش از 250 هزار خواهد بود. بنابراین روش PCR روش کارا در ازدیاد یک قطعه از DNA است.

کاربردهای مهم PCR

  • تهیه نسخه‌های متعدد از یک ژن مورد نظر: گاهی برای مطالعات بیولوژی مولکولی لازم است که یک ژن با نسخه‌های نسبتا زیاد در دسترس باشد. بدین منظور می‌توان با استفاده از روش PCR ژن مورد نظر را در مقایسه با بقیه ژن‌ها تکثیر نمود.

  • بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن: با استفاده از این روش می‌توان تشخیص داد که آیا یک ژن در یک سلول حضور دارد یا نه؟ گاهی نیز از این مطالعات برای بررسی وجود ژنهای مختلف باکتری‌ها یا ویروس‌ها در بدن افراد استفاده می‌کنند.

  • تشخیص بیماری‌های قبل از تولد: با استفاده از PCR و بکار گرفتن پرایمرهای مربوط به یک ژن بیمار و پرایمرهای مربوط به ژن سالم آلل آن می‌توان از تولد کودکان دارای بیماری‌های ژنتیکی جلوگیری کرد. برای این کار بعد از لقاح تخمک در آزمایشگاه ، بعد از رسیدن تخمک به حالت 10 سلولی ، یک سلول را جدا کرده و با استفاده از پرایمرها از ژن مورد نظر PCR صورت می‌گیرد، اگر بعد از PCR منحصرا ژن سالم تکثیر پیدا کرد، این مفهوم هموزیگوت بودن سلول‌های جنینی و سالم بودن آنهاست.

  • تعیین جنسیت جنین: معمولا چند تخمک با چند اسپرم در آزمایشگاه لقاح می‌یابند و سپس اجازه تکثیر به سلول تخم داده و با رسیدن تخم به مرحله ده سلولی ، یکی از سلول‌ها را جدا کرده و بوسیله پرایمرهای ویژه مربوط به کروموزوم y مورد PCR قرار می‌گیرد. کروموزوم y منحصرا در سلول‌های نر دیده می‌شود. اگر قطعه تولید نشده در PCR بوسیله الکتروفورز و بطور دقیق‌تر توسط ساترن بلوتینگ تشخیص داده شد، جنین از نوع پسر و در غیر این صورت دارای کروموزوم‌های xx خواهد بود.

تشخیص بیماریها

کشت میکروبها که جهت تشخیص بیماریهای عفونی در اکثر آزمایشگاهها بکار می‌رود. زمان‌بر بوده و ثانیا باعث افزایش تعداد میکروب‌های بیماریزا و غیر بیماریزا در شرایط آزمایشگاهی می‌گردد. امروزه در برخی آزمایشگاهها روش PCR جایگزین روش‌های کشت شده است. یعنی قطعه‌ای از ژن مربوط به میکروب بیماریزا مورد شناسایی قرار گرفته و پرایمرهای مربوط تولید می‌شوند، با استفاده از این پرایمرها می‌توان تشخیص داد که آیا ویروس ایدز در داخل بدن وجود دارد یا نه؟



مشکل PCR و راه حل آن

اشکال PCR ، آلودگی نمونه‌های مورد بررسی توسط قطعات DNA خارجی است. اگر قبلا در داخل دستگاهی PCR یک نمونه انجام گرفته باشد. و ذره کوچکی از آن در داخل دستگاه باقی بماند. در PCR نمونه بعدی مشکل ایجاد خواهد کرد. برای رفع مشکل امروزه از ظروف یکبار مصرف استفاده می‌شود. کلیه ظروف قبل از استفاده اتوکلاو می‌شوند تا سلول‌ها و مولکولهای موجود در آنها ، حتی‌الامکان غیر فعال می‌شوند.

یکی از روش‌های پیشنهادی انجام PCR داخلی یا Nestied PCR است. از این روش با استفاده از دو پرایمر قطعه‌ای از DNA را تکثیر می‌دهند و سپس قطعه‌ای دیگر در داخل DNA‌های تکثیر شده PCR می‌شود. بدین صورت احتمال آلودگی کاهش می‌یابد.





نوع مطلب :
برچسب ها : PCR، DNA،


پنجشنبه 11 آذر 1389 :: نویسنده : امین شیرین نیا

از این تست برای شناسایی انتی بادی های ناقص- که بر روی RBC نشسته و انها را حساس کرده است  استفاده می شود . این تست به دو روش مستقیم و غیر مستقیم انجام می شود . اساس این تست بر ایجاد شبکه بین آنتی بادی های ناقص در سطح گلبول های قرمز حساس شده (توسط AHG) برای ایجاد آگلوتیناسیون می باشد .این تست در دو مرحله کلی انجام می شود :

  1. مرحله حساس شدن
  2. اضافه کردن معرف کومبس


  • کومبس مستقیم

از کومبس مستقیم برای شناسایی آنتی بادی های ناقص متصل به RBC جنین استفاده می شود . تفاوتی که بین کومبز مستقیم و غیر مستقیم وجود دارد این است که ،  مرحله حساس شدن گلبول های قرمز در بدن جنین اتفاق می افتد . عامل اصلی حساس شدن RBC (در 75 % موارد) ناسازگاری گروه های خونی RH میباشد هر چند که گروه های خونی ABO در 25 درصد موارد هم می توانند باعث حساس شدن RBC شوند .

ناسازگاری RH

اگر خون جنینRh+   و خون مادر Rh- باشد آنتی بادی های تولید شده از کلاس Igg در بدن مادر از جفت عبور کرده و باعث حساس شدن RBC های جنین می شود .

ناسازگاری ABO

این ناسازگاری زمانی باعث حساس شدن RBC می شود که گروه خونی مادرO و گروه خونی جنین , AB باشد در این صورت انتی بادی Igg3 انتی AB موجود در سرم مادر به جنین منتقل شده و باعث حساس شدن RBC جنین میشود .

 

روش انجام تست کومبس مستقیم

خون بند ناف را گرفته و از ان سوسپانسیون 5 درصد گلبول های قرمز تهیه می کنیم . چون مرحله حساس شدن RBC در بدن جنین اتفاق افتاده است بنابراین نیازی به انکوبه کردن نیست .

0.1 میلی لیتر از سوسپانسیون 5 درصد RBC را به 0.1 میلی لیتر AHG اضافه می کنیم و برای تشکیل شبکه بین RBC ، لوله های تست را به مدت 3 تا 5 دقیقه در دمای آزمایشگاه نگه می داریم . بعد از 5 دقیقه ، لوله ها را درRpm 1000و  به مدت یک  دقیقه سانتریفیوژ می کنیم . در اخر هم لوله ها را از نظر آگلوتیناسیون با زدن ضربه ای ضعیف به لوله ، برسی می کنیم .

 برسی نتایج

اگر اگلوتیناسیون مشاهده شود ، نشان دهنده حساس بودن RBC جنین است و باید تعین تیتر شود (که در این تعین تیتر ،  AHG را رقیق می کنیم نه سرم را ) چون در زایمان دوم به بعد باعث HDN در نوزادان می شود .

تفسیر آزمایش:
اگر آزمایش مثبت باشد دلیل بر حساس بودن گلوبول های قرمز بیمار می باشد.

کاربرد آزمایش :

۱-تشخیص بیماری اریتروبلاستوز جنینی Erythroblastosis fetalis
2-واکنشهای انتقال خون ناجور
۳-تشخیص آنمی همولیتیک اتوایمیون
۴-حساس شدن گلوبول های قرمز در اثر مصرف دارو

 





نوع مطلب : سرولوژی، 
برچسب ها : کومبس، RH، IgG3،


یا RA (روماتوئید آرتریت) یا RF (روماتوئید فاکتور) این تست در تشخیص آرتریت روماتوئید اختصاصی است. آرتریت روماتوئید یک بیماری «خود ایمنی»، «اتو ایمون» است که بیشتر در افراد میانسال و مسن دیده می‌شود ولی یک نوع آن به نام Juvenile Rheumatoid Arthritis در کودکان هم دیده می‌شود. بر اثر برخی عفونت‌ها در مفاصل تورم ایجاد می‌شود که این تورم باعث ترشح یک نوعIgG می‌شود که روی آنتی‌‌ژن‌های تثبیت شده در مفصل نشسته و کمپلمان را جذب می‌نماید، این کمپلکس موجب ترشح مواد آنافیلاتوکسیک می‌شود که باعث جذب سلول‌های آماسی می‌گردد و این سلولها لیزوزیم ترشح می‌نمایند. این لیزوزیم باعث تغییر IgG تثبیت شده در سطح مفصل می‌گردد وآن را وادار به تولید آنتی‌ژن جدیدی می‌کند که بدن علیه آن آنتی‌کور ترشح می‌کند که از نوع IgM است و فاکتور RF نامیده می‌شود، تسلسل تولید این دو نوع آنتی‌کور IgG وIgM تا انهدام کامل مفصل ادامه پیدا می‌کند. بیماری آرتریت روماتوئید حاد با لاتکس مثبت تقریباً ارثی است و در افراد دارای HLA خاصی بروز می‌کند، این آنتی‌ژن ‌را می‌توان روی لنفوسیت‌های B و ماکروفاژهای افراد مبتلا جستجو نمود و افرادی که ازین HLA نیستند درصورت ابتلاء به نوع بسیار خفیف گرفتار می‌شوند و تست لاتکس آنها منفی است.






نوع مطلب : سرولوژی، 
برچسب ها : IgG، IgM، RF، RA، روماتوئید فاكتور، روماتوئید آرتریت، خود ایمن،


سه شنبه 2 آذر 1389 :: نویسنده : امین شیرین نیا

پایه اساسی آزمون الایزا براساس واكنش آنتی‌بادی با آنتی‌ژن می‌باشد. در آزمون‌های الایزا یك آنتی‌بادی اختصاصی با یك آنتی‌ژن مشخص واكنش داده و سپس با استفاده از یك آنتی‌بادی اتصال یافته با یك آنزیم بعنوان سیستم نشانگر، آزمون ادامه یافته و درنهایت با افزودن سوبسترای آنزیم و تبدیل سوبسترا به محصول كه یك مادة رنگی می‌باشد آزمون الایزا به پایان می‌رسد طول موج رنگ بدست آمده كه نشانگر حضور یك آنتی‌بادی (و یا آنتی‌ژن) و نیز غلظت آن می‌باشد توسط یك دستگاه اسپكتروفتومتر قرائت شده و ثبت می‌گردد.

بعنوان مثال در یكی از رایج‌ترین روشهای الایزا ( روش غیر مستقیم) كه برای شناسایی حضور و یا عدم  حضور آنتی‌بادی برعلیه یك آنتی‌ژن موردنظر بكار می‌رود ابتدا یك آنتی‌ژن برروی سطح جامد پوشش داده  می‌شود سپس نمونة مجهول كه حضور و یا عدم حضور آنتی‌بادی برعلیه این آنتی‌ژن درون آن مورد بررسی قرار می‌گیرد بر روی این سطح جامد پوشش داده شده با آنتی‌ژن, افزوده می‌شود. پس از آن آنتی‌بادی ثانویه یا درحقیقت آنتی‌بادی برعلیه این آنتی‌بادی اولیه كه متصل به آنزیم نیز می‌باشد افزوده می‌شود و در نهایت سوبسترای آنزیم در اختیار آنزیم قرار داده می‌شود و پس از گذشت مدت زمان لازم واكنش آنزیمی خاتمه داده شده و رنگ بدست آمده توسط دستگاه اسپكتروفتومتر قرائت می‌شود.

-2-1  مراحل یك آزمون الایزا

مراحل انجام یك آزمون الایزا به‌صورت زیر می‌باشد:

1)    جذب یك آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی به سطوح جامد پلاستیكی كه اصطلاحا پوشش‌دهی نامیده می‌شود.

2)     افزودن نمونه‌های مورد آزمایش

3)     انكوباسیون واكنشگرها برای دراختیاز قراردادن مدت زمان كافی برای انجام واكنش

4)     جدا نمودن واكنشگرهای متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهای آزاد و متصل نشده با استفاده از عمل شستشو

5)     افزودن عوامل متصل شده با آنزیم

6)     انكوباسیون واكنشگرها برای دراختیار قراردادن مدت زمان كافی برای انجام واكنش

7)     جدا نمودن واكنشگرهای متصل شده و واكنش داده از واكنشگرهای آزاد و متصل نشده با استفاده عمل شستشو

8)     افزودن سوبسترای آنزیم جهت تشخیص واكنش دهنده‌ها

9)     انكوباسیون واكنشگرها برای دراختیار قراردادن مدت زمان كافی برای انجام واكنش

10) خاتمه دادن واكنش آنزیمی توسط متوقف كننده‌ها و قرائت دانسیتة نوری بدست آمده توسط دستگاه اسپكتروفتومتر

شرح مراحل فوق در ادامه آمده است:

3-2-2  فاز جامد

امروزه بیشتر از پلیت‌های 96 خانه‌ای بعنوان فاز جامد استفاده می‌شود. انواع انعطاف‌پذیر و جداشدنی از پلی‌وینیل كراید و انواع سخت و محكم از پلی‌استیرن ساخته می‌شوند. هم ‌اكنون شركت‌های معتبر و متعددی به‌ساخت انواع مختلف پلیت‌های الایزا مشغول هستند دربعضی از انواع این پلیت‌ها، كف چاهك‌ها صاف و تخت بوده و بعضی دیگر مقعر می‌باشند.

 بعضی از پلیت‌ها دارای خاصیت چسبندگی بالا بوده و بعضی دارای چسبندگی متوسط می‌باشند. امروزه آزمایشهای متعددی با موفقیت با هر كدام از این نوع پلیت‌ها انجام می‌شود و نمی‌توان گفت كه قطعا كدام نوع پلیت برتری بر دیگر انواع پلیت‌ها دارد. می‌توان با انجام دو آزمایش الایزای كاملا یكسان كه تنها در نوع پلیت متفاوتند و بررسی نتایج تشخیص داد كه برای كدام نوع از آنتی‌ژن، كدام پلیت بهتر است. بطور كلی پلیت‌هایی كه انتهای چاهك‌های آنها تخت می‌باشد توصیه می‌شود.

3-2-3 پوشش‌دهی

این مرحله كه یكی از مهمترین مراحل آزمون الایزا می‌باشد عبارتست از اتصال پروتئین آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی بر  روی پلیت ,درون چاهك‌ های یك پلیت 96 خانه‌ای, كه عمدتا براساس واكنش‌ های آبگریز مابین ماتریكس پلاستیكی و پروتئین می‌باشد. بنابراین هر پروتئین یك ثابت اتصال متفاوتی با پلیت‌ها دارد. این واكنش بستگی به  بار خالص پروتئین ندارد.

 بنابراین افزودن هیدروفوبیسیتة واكنش پروتئین – پلیت موجب بروز این نواحی هیدروفوب در پروتئین‌ها شده و واكنش مابین پلیت و پروتئین را مستحكم‌ تر می‌ نماید، این دناتوره نمودن جزیی  پروتئین‌ها توسط قراردادن پروتئین در معرض دترژنت‌های ملایم و مواد دارای pH پائین حاصل می‌شود كه بعد از این مجاورت می‌توان با استفاده از یك روش دیالیز مناسب، بافر پوشش‌دهی را با این مواد دناتوره كننده تعویض نمود.

 عمل پوشش‌دهی به عوامل زیر بستگی دارد.

الف) مدت زمان پوشش‌دهی

ب) دما

ج) غلظت پروتئین‌هایی كه باید پوشش داده شوند.

د)‌ نسبت سطح چاهك‌ها به حجم محلول پوشش دهی

هـ) ضریب انتشار مولكولهای پروتئینی درون محلول پوشش‌دهی درون چاهك‌ها

عوامل فوق یكپارچه بوده و جدای از یكدیگر نیستند. یكی از مهمترین موارد بدست آوردن غلظت مناسب از پروتئین برای اتصال مناسب به پلیت می‌باشد كه از طریق تیتراسیون پروتئین بدست می‌آید.

محدودة 1 تا 10 μg/ml در حجم 50μl یك راهنمایی خوبی برای بدست آوردن غلظت مناسب اغلب پروتئین‌ها جهت اتصال خوب به پلیت می‌باشد البته این محدوده وابستگی به خلوص نسبی پروتئین موردنظر جهت پوشش‌دهی دارد بنابراین غلظت یك پروتئین جهت پوشش‌دهی وابسته به فعالیت آن پروتئین می‌باشد مشخص است كه یك محلول پروتئینی كه دارای مقدار كمی از پروتئین موردنظر باشد مقدار اتصال آن پروتئین به پلیت برطبق نسبت حضور آن پروتئین در محلول كم می‌باشد و ناخالصی‌های موجود در محلول پروتئینی سطوحی را كه باید پروتئین موردنظر ما در اختیار داشته باشد اشغال می‌نمایند كه در نهایت منجر به یك اندازه‌گیری ضعیف می‌شود.

 با استفاده از چند تست الایزا كه در آنها غلظت پروتئین موردنظر برای پوشش‌دهی متفاوت است می‌توان به یك غلظت مناسب از پروتئین جهت پوشش دادن دست یافت. توجه به این مطلب مهم است كه دانسیتة اتصال پروتئین به پلیت درنتیجة نهایی بسیار مهم است. اتصال با دانسیتة بالا حتی ممكن اسب برخلاف انتظار ما به نتایج ضعیف منجر شود چرا كه این دانسیتة بالا می‌تواند از لحاظ قضایی اجازة نزدیك شدن پروتئین دوم (آنتی‌ژن یا آنتی‌بادی) را به پروتئین پوشش داده شده ندهد. درحقیقت مولكولهای پروتئین پوشش داده شده آنقدر باشدت و استحكام بالایی (و بینابین یكدیگر) به سطح چاهك متصل شده‌اند كه حتی جایگاه‌های اتصالشان در دسترس اتصال به پروتئین دوم (فرضا آنتی‌بادی) نمی‌باشد.

 غلظت‌های بالای پروتئینی كه باید پوشش داده شود نیز منجر به‌همین مسئله می‌شود.  رابطه غلظت یك آنتی‌ژن یا  آنتی‌بادی با چگالی نوری (OD) بدست آمده در مرحلة نهایی تست الایزا یك رابطة خطی صرف نمی‌باشد و برای هر پروتئینی بسته به فرم فضایی آن پروتئین و نیز در هر محدوده‌ای از غلظت‌های مختلف آن پروتئین متفاوت می‌باشد.

میزان هیدروفوبیسیتة واكنش پروتئین – پلیت وابسته به دما نیز می‌باشد افزایش دما موجب افزایش این  هیدروفوبیسته می‌شود  و دانستیم كه این افزایش منجر به اتصال مستحكم‌ تر پروتئین به پلیت می‌ شود یكی از   رایج‌ترین روش‌های پوشش‌دهی از لحاظ دما، در مجاورت قراردادن پلیت با پروتئین در دمای 37°c می‌ باشد  كه در این دما بین 1 تا 3 ساعت زمان مناسبی برای اغلب پروتئین‌  ها می‌باشد در مرتبة بعد می‌توان روش  پوشش‌دهی در طول شب در 4°c و یا تركیبی از ایندو را بكار گرفت.

بسته به ماهیت پروتئین‌ها، گاهی اوقات پوشش‌دهی در دمای آزمایشگاه با مدت زمان طولانی‌تر موردنظر قرار می‌گیرد.

البته مشخص است كه افزایش دما در مدت زمان طولانی ممكن است باعث تغییراتی در ساختار پروتئین موردنظر جهت اتصال به پلیت شود. تكان دادن یكنواخت، آرام و منظم پلیت نیز می‌تواند با افزایش میزان برخورد و درنتیجه اتصال پروتئین به پلیت، زمان موردنظر برای پوشش‌دهی را كاهش دهد.

3-2-3-1  بافر پوشش‌دهی

بیشترین بافرهایی كه هم‌اكنون مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارتند از :

  • بافر كربنات 6/9 = pH با كربنات 50  میلی مولار،

  •  Tris – Hcl   بیست میلی مولار با pH = 8/5 و یا

  •  PBS   10 میلی مولار با pH = 7/2

 اغلب روش‌های الایزا از یكی از این سه نوع بافر استفاده می‌نمایند.

 بافرهایی غیر از موارد فوق هنگامی مورد استفاده قرار می‌گیرند كه مشكلی در پوشش‌دهی با بافرهای فوق بوجود آمده باشد. از لحاظ تئوری بهترین بافری كه مورد  استفاده قرار می‌ گیرد بافری است كه دارای pH برابر با 1 تا 2 واحد بالاتر از (PI) پروتئین اتصالی باشد. اما درعمل اندازه‌گیری این مطلب آسان نمی‌باشد چراكه پروتئین اتصالی (فرضا آنتی‌ژن) حاوی مخلوطی از پپتیدهای متفاوت می‌باشد. با انجام چند آزمایش الایزا كه pH‌های متفاوت و قدرت یونی متفاوتی در بافر پوشش‌دهی داشته باشد می‌توانیم اتصال بهتر و مناسب‌تر پروتئین به پلیت را بدست آوریم.

پروتئین‌ های با خاصیت اسیدی، احتیاج به یك pH پائین‌ تر جهت خنثی نمودن نیروی دافعه مابین پروتئین و پلیت دارند و در آزمایشی جهت پوشش دادن پروتئین‌ های ویروس Herpes simplex كه خاصیت اسیدی دارند بهترین pH در محدودة 5/2 تا 6/4 بدست آمده است.

در روش‌ های رایج امروزی پوشش دادن با بافر PBS یا كربنات اغلب موفقیت‌آمیز است.

گاهی اوقات بعضی از آنتی‌ژن‌ها مشكلاتی را در پوشش‌دهی بوجود می‌آورند این آنتی‌ژن‌ها شامل پلی‌ساكاریدها لیپوپلی‌ساكاریدها و گلیكولیپیدها هستند كه پوشش‌دهی مستقیم را منجر به نتایج ضعیف و نامناسب می‌نمایند در اینگونه موارد یك پوشش‌دهی ابتدایی موردنیاز است كه با یك آنتی‌سرم اختصاصی انجام می‌شود كه یك حالت ساندویچی را بوجود می‌آورد كه در ادامة همین فصل توضیح داده خواهد شد.

بنابراین مخلوط تخلیص نشده آنتی‌ژن‌ها مناسب برای پوشش‌دهی مستقیم نمی‌باشد و درصورت نیاز از الایزای ساندویچی استفاده می‌شود.

بدلیل ماهیت غیر كووالانسی اتصالی پروتئین به پلیت، جداشدن یك پروتئین از پلیت نیز ممكن است رخ دهد اما اگر شرایط پایدار و استاندارد باشد این مطلب تأثیر مهمی در یك آزمون الایزا نخواهد گذاشت.





نوع مطلب : سرولوژی، 
برچسب ها : الایزا، آنتی ژن، انتی بادی، فاز جامد،




درباره وبلاگ


وظیفه اصلی رشته علوم آزمایشگاهی شناخت علل ایجاد بیماریهای مختلف و عوامل ایجاد کننده آنها می‌باشد. ابزاری که در تشخیص و درمان بیماری‌های مختلف بکار می‌رود تحت عنوان پاراکلینیک می‌باشد که می‌توان به رشته‌هایی از قبیل رادیولوژی، رشته‌های توانبخشی و پرستاری اشاره کرد.
در این رشته می‌توان به نکته مهمّی اشاره کرد و آن آزمایشگاه‌های مجهز است که طی سال‌های اخیر توسط بخش دولتی و خصوصی گسترش یافته و زمینه مناسبی را برای اشتغال در این رشته فراهم نموده در حال حاضر این رشته در دو مقطع کاردانی و کارشناسی ناپیوسته در اغلب دانشگاههای علوم پزشکی کشور دانشجو می‌پذیرد.
در پایان قابل‌ ذکر است که این رشته به دلیل نیاز به امکانات و وسائل، یکی از رشته‌های پرهزینه است. البته در دانشگاه های علوم پزشکی کشور، اغلب وسائل و امکانات در اختیار دانشجویان قرار می‌گیرد.
کار و تحصیل در این رشته به دلیل خطر بالای آلودگی محیط آزمایشگاهها نیازمند توجه و دقت بالائی است

مدیر وبلاگ : امین شیرین نیا
نویسندگان
نظرسنجی
به کدام یک از رشته های زیر علاقه دارید؟








جستجو

آمار وبلاگ
کل بازدید :
بازدید امروز :
بازدید دیروز :
بازدید این ماه :
بازدید ماه قبل :
تعداد نویسندگان :
تعداد کل پست ها :
آخرین بازدید :
آخرین بروز رسانی :
پایگاه اینترنتی امدادگران ایران  www.emdadgar.com

                    
 
 
 
شبکه اجتماعی فارسی کلوب | Buy Website Traffic | Buy Targeted Website Traffic